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Microbiologie & Sciences Humaines

16S Yourself

La taxonomie répond à un besoin des microbiologistes de classer et identifier précisément les souches des microorganismes qu'ils isolent ou détectent sur la base de critères fiables. Parmi les bactéries, l'espèce est un taxon particulièrement difficile à définir car les critères utilisés sont difficiles à appliquer à tous les clades; ainsi savoir si deux souches appartiennent à deux espèces distinctes ou non repose souvent sur des critères arbitraires.

Si lors du développement de la microbiologie les critères taxonomiques étaient phénotypiques (coloration de Gram, caractères biochimiques...) et limités, l'apparition dans les années 1980 des techniques moléculaires a grandement modifié la taxonomie, en particulier le développement du séquençage dans les années 1970 puis des séquenceurs automatiques à partir des années 1990.

Les critères moléculaires actuellement utilisés sont l'hybridation ADN-ADN et la comparaison de séquences d'ADN comme l'ARNr 16S. Pour l'hybridation ADN-ADN, deux souches appartenant à la même espèce doivent présenter des valeurs d'hybridation supérieures à 70 % [Wayne et al., 1987 ; Stackebrandt et al., 2002]. Pour l'ARNr 16S, des niveaux d'identité nucléotidiques supérieurs ou égaux à 95 % et supérieurs ou égaux à 98,7 % sont requis aux niveaux du genre et de l'espèce, respectivement (ce dernier seuil était précédemment de 97%) [Stackebrandt et al., 1994 ; 2006].

L'ARNr 16S présente plusieurs limites : ce genre est conservé et ainsi ne permet pas systématiquement une détermination correcte au niveau de l'espèce ; il a été montré chez certaines souches la présence de plusieurs copies de l'ARNr 16S ainsi qu'une variabilité pouvant atteindre 1 %, voire dépasser 1,3 % chez certaines souches, ce qui correspond au seuil de l'espèce [Pei et al, 2010].

Si l'ARNr 16S présente les limites évoquées précédemment, actuellement sa séquence est disponible pour la plupart des souches-types des espèces possédant une nomenclature officielle, ce qui n'est pas le cas d'autres gènes. Près de 3 millions de séquences d'ARNr 16S sont actuellement disponibles dans les bases de données [http://www.http://rdp.cme.msu.edu/] ce qui rend encore plus solide cet outil. C'est pourquoi l'analyse de cette séquence demeure encore très largement pratiquée par les équipes de recherche.

Toutefois, il est clair que la variabilité des séquences d'ARNr 16S entre genres bactériens a été sous-évaluée lors de la mise au point des seuils de 95 % pour le genre et 98,7 % pour l'espèce et que ces valeurs sont loin de s'appliquer à tous les microorganismes. Les valeurs de 95 et 98,7 % restent arbitraires et ont été mises au point après analyse d'un nombre limité de taxa et il n'existe pas depuis de seuil applicable à l'ensemble des bactéries.

De plus, au sein de certains genres bactériens, il a été rapporté plusieurs espèces validées ayant présenté des séquences ARNr 16S identiques malgré des phénotypes différents, comme c’est le cas pour le genre Mycobacterium [Clarridge, 2004]. L’application stricte du critère en vigueur aboutirait à la suppression de nombreuses espèces validées.

Au niveau du genre, de nombreux auteurs ont critiqué la valeur seuil de 95 % car elle ne s'applique pas à tous les genres bactériens. Par exemple le pourcentage d'identité minimum observé entre les différentes espèces des genres Streptomyces et Chlorobium est de 78 et 86,1 %, respectivement, ce qui justifierait, en fonction des critères en vigueur, la création de nouveaux genres [Alexander et al., 2002].

Devant ces discordances, nous avons souhaité évaluer les variations de similarité des séquences ARNr 16S entre espèces bactériennes validées. Pour cela, nous avons focalisé notre analyse sur les bactéries appartenant à des genres associés à l'homme.

Les séquences ARNr 16S de ces espèces ont été obtenues dans la base de données LPSN  (http://www.bacterio.net/). Les résultats sont présentés par genres, détaillant les valeurs minimum et maximum de similarité entre espèces validées.

 

Taxonomy responds to a requirement, for microbiologists, to classify and identify with precision the bacterial strains they isolate or detect, on the basis of reliable criteria.

Among bacteria, the species status is particularly difficult to describe as a taxon, because the criteria used are difficult to apply to every clade; thus, determining if two strains belong to distinct species or not often relies on arbitrary criteria.

Altough initially taxonomical criteria were phenotypic (Gram staining, biochemical features…), and were limited, the development in the 1980’s of molecular technologies has greatly changed the taxonomy, particularly the development of 16S rRNA sequencing in the 1970’s, then the development of automated sequencers from the 1990’s.

The official molecular criteria currently used include DNA-DNA hybridization (DDH) and comparison of 16S rRNA sequences. Using DDH, two strains belong to the same species if they exhibit hybridization values > to 70% [Wayne et al., 1987; Stackebrandt et al., 2002]. For16S rRNA, nucleotidic identity thresholds ≥ 95% and 98.7% are required at the genus and species levels, respectively [Stackebrandt et al., 1994; 2006].

However, 16S rRNA-based taxonomy suffers several limits: this gene is conserved and thus doesn’t provide an accurate determination at the species level; it has been shown, within some strains, the presence of several copies of 16S rRNA, and for some of these strains there is variability that can be > to 1,3%, that is actually the threshold of the species level for some strains [Pei et al, 2010].

Despite these limits, 16S rRNA sequences are currently available for almost all type strains of species with standing in nomenclature, which isn’t the case for other genes. Almost 3 millions of 16S rRNA sequences are currently available in databases [http://www.http://rdp.cme.msu.edu/]. This is why the analysis of this gene remains widely used by research teams.

However, it is clear that the variability of 16S rRNA sequences between bacterial genera has been underestimated. Values of 95% and 98.7% remain arbitrary and have been determined after analysis of a limited number of taxa.

Moreover, within some bacterial genera, it has been reported several validated species with identical 16S rRNA sequences while showing different phenotypes, as is the case for the genus Mycobacterium [Clarridge, 2004]. A strict application of the current criteria would result in to the suppression of many species with standing in nomenclature.

At the genus level, numerous authors also criticized the 95% threshold because it doesn’t apply to all bacterial genera. For instance the minimum percentage observed between the different species of Streptomyces and Chlorobium genera is 78 and 86.1% respectively, which would justify, according to the current criteria, creation of new genera [Alexander et al., 2002].

In front of these discrepancies, we wanted to estimate the variations of similarity of the 16S rRNA sequences among bacterial species and genera with standing in the nomenclature. To do this, we focused our analysis on bacteria associated with humans.

16S rRNA sequences were obtained from the LPSN database (http://www.bacterio.net/). Results are shown by genus and we detailed the minimum and maximum values between species for all genera.


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