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Microbiologie & Sciences Humaines

Equipe n°7: Laurent Papazian, PU-PH

Infections respiratoires sévères émergentes et leur prise en charge

 

 

Composition de l’équipe

 

  1. Laurent PAPAZIAN, PU-PH, HDR
  2. Pascal THOMAS, PU-PH, HDR
  3. Christophe DODDOLI, PU-PH, HDR
  4. Antoine ROCH, PU-PH, HDR
  5. Fabienne BREGEON, MCU-PH, HDR

 

1 -.Introduction : thèmes de recherche

 

Thème 1 : Identification de nouveaux agents de pneumonies

Recherche exhaustive d’agents de pneumonies nosocomiales dans 2 réanimations.

Réalisation d’une étude métagénomique sur les prélèvements de patients pour lesquels aucun agent n’a pu être identifié.

Recherche de la signification clinique d’une séroconversion à Mimivirus.

Etude de l’incidence et facteurs de risque des pneumonies à Cytomegalovirus chez les patients ventilés.

 

Thème 2 : Modèle expérimental de pneumonie : Pharmacologie – Interactions avec la ventilation mécanique

Effets des variations volémiques sur la pharmacocinétique plasmatique et la concentration tissulaire pulmonaire de la caspofongine sur modèle porcin.

Etude du bénéfice d’une curarisation sur le développement des lésions induites par la ventilation mécanique au cours d’une pneumonie infectieuse.

Effets des gaz halogénés sur la clairance alvéolaire et l’oedème pulmonaire dans un modèle murin de pneumopathie à Pseudomonas aeruginosa.

 

Thème 3 : Optimisation de la prise en charge des infections respiratoires

Etude clinique sur les statines et mortalité des pneumonies acquises sous ventilation mécanique.

Etude de la place de la procalcitonine sérique et dans le LBA dans le diagnostic des pneumonies acquises sous ventilation mécanique.

Analyse des étiologies des pneumonies post-opératoires et adaptation de l’antibioprophylaxie en chirurgie pulmonaire.

 

2 -.Travaux réalisés sur la thématique au cours du plan quadriennal en cours


Thème 1 : Identification de nouveaux agents de pneumonies

1.1 – Justification

Malgré les progrès accomplis dans le diagnostic étiologique des pathogènes responsables d’infections respiratoires grâce aux techniques conventionnelles et aux outils de biologie moléculaire, de nombreuses causes de pneumonies demeurent non élucidées. Cela concerne tout autant les infections communautaires que les infections nosocomiales. Deux axes semblent donc très importants: 1°) la mise en évidence de nouveaux microorganismes sur des prélèvements spécifiques au moyen d’outils sophistiqués de biologie moléculaire (LBA, parenchyme pulmonaire, sang) ; et 2°) la mise en évidence du caractère pathogène de ces micro-organismes par des études cliniques épidémiologiques ou interventionnelles.

 

1.2 – Mise en évidence de nouveaux agents de pneumonie

Tropheryma whipplei est l’agent étiologique de la maladie de Whipple. En utilisant du 16SrDNA et une technique de PCR quantitative, nous avons mis en évidence la présence de l’ADN de Tropheryma whipplei au niveau de lavages broncho-alvéolaires (LBA) de 6 patients de réanimation (sur un total de 210 LBA). Tropheryma whipplei pourrait ainsi être un agent de pneumonie, en particulier lors des pneumonies d’inhalation surinfectées (Bousbia S, Papazian L, Auffray JP, Fenollar F, Martin C, Li W, Chiche L, La Scola B, Raoult D. Tropheryma whipplei in patients with Pneumonia. Emerg Infect Dis. 2010;16(2):258-63.).

1.3 – Mise en évidence du caractère pathogène des agents de pneumonie

Acanthamoeba polyphaga Mimivirus est un virus géant récemment découvert (La Scola B. et al. Science 2003; 299, 2033) et séquencé (Raoult D. Science 2004; 306, 1344–1350). Il s’agit d’un virus retrouvé dans l’eau, associé à des amibes. Une séroconversion a été retrouvée chez certains patients de réanimation (La Scola et al. Emerging Infect Dis 2005 ; 11: 449-452; Berger P. et al. Emerging Infect Dis 2006 ; 12: 248-255). Nous avons cherché à préciser l’incidence d’une séroconversion à Mimivirus et d’en préciser la morbi-mortalité chez les patients suspects de pneumonie acquise sous ventilation mécanique (PAVM). En réalisant une étude prospective de cohorte avec appariement, nous avons montré que les patients présentant une séroconversion pendant leur séjour en réanimation étaient ventilés 7 jours en plus et séjournaient en réanimation 10 jours de plus que les patients ne présentant pas de séroconversion à Mimivirus (Vincent A, La Scola B, Forel JM, Pauly V, Raoult D, Papazian L. Clinical significance of a positive serology for mimivirus in patients presenting a suspicion of ventilator-associated pneumonia. Crit Care Med. 2009;37(1):111-8).

Le Cytomegalovirus fait partie des agents dorénavant reconnus de pneumonie nosocomiale. En étudiant 242 patients de réanimation ventilés plus de 48 h en réalisant des antigénémies pp65 hebdomadaires et lors de toute suspicion de PAVM (avec recherche sur LBA), nous avons rapporté une incidence de 16,1 % d’infections actives à Cytomegalovirus. Nous avons rapporté un allongement de la durée de ventilation et d’hospitalisation associé au Cytomegalovirus. L’analyse multivariée montre que le Cytomegalovirus est associé à la mortalité en réanimation (Crit Care Med. 2009 Jun;37(6):1850-7. Active cytomegalovirus infection is common in mechanically ventilated medical intensive care unit patients. Chiche L, Forel JM, Roch A, Guervilly C, Pauly V, Allardet-Servent J, Gainnier M, Zandotti C, Papazian L).

 

Thème 2 : Modèle expérimental de pneumonie


2.1 - Justification

La ventilation mécanique peut majorer les lésions de poumons préalablement endommagés. Ces mécanismes reposent essentiellement sur le principe de baro/volo-traumatisme aboutissant à la surdistension et à la destruction de certaines zones du poumon (Parker, et coll. Crit Care Med 21 :131-143, 1993). Bien que les mécanismes intimes du principe de ventilator-induced lung injury (VILI) soient mal connus, l’hypothèse d’une initiation des lésions par la mise en jeu de mécanismes inflammatoires peut être avancée. Il persiste de nombreuses incertitudes tant sur le plan de la prévention que de la compréhension de ces mécanismes.

 

2.2 - Effets des variations volémiques sur la pharmacocinétique plasmatique et la concentration tissulaire pulmonaire de la caspofongine sur modèle porcin.

La caspofongine est un nouvel agent thérapeutique utile chez le patient de réanimation sous ventilation mécanique. Sa pharmacocinétique permet une administration quotidienne unique. Cependant, on sait peu des variations du volume de distribution sur sa pharmacocinétique ainsi que sur sa pénétration tissulaire, notamment pulmonaire (Threutetzbacher2004, Stone2004). Dans les conditions d’un choc hypovolémique suivi d’une réanimation volémique, nous avons observé une diminution de 37% de la concentration plasmatique maximale de caspofongine ainsi qu’une diminution de 25% de l’exposition pulmonaire de la caspofongine sans modification de la pénétration pulmonaire. Des travaux complémentaires cliniques permettront de définir si une augmentation des posologies est nécessaire chez les patients en état de choc. (Effect of fluid loading during hypovolemic shock on caspofungin pharmacokinetic parameters in pig. Antoine Roch, Christian Woloch, Dorothée Blayac, Caroline Solas, Sylvie Quaranta, Vincent Mardelle, Matthias Castanier, Laurent Papazian and Emmanuelle Sampol-Manos. Submitted to Intensive Care Medicine).

 

2.3 - Bénéfice d’une curarisation sur le développement des lésions induites par la ventilation mécanique au cours d’une pneumonie infectieuse.

La ventilation mécanique constitue, en dehors du traitement étiologique, la modalité de prise en charge universelle des malades présentant un syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) en suppléant la fonction respiratoire et en assurant l’hématose. Les curares sont utilisés chez environ 50% des patients présentant un SDRA. Les curares pourraient favoriser la survenue de condensations pulmonaires postérieures. Ainsi, les effets potentiellement bénéfiques sur la limitation des pressions d’insufflation (diminuant le risque de barotraumatisme) pourraient être contre balancés par une hypoxémie liée à la constitution d’atélectasies.  Chez le porc, nous avons montré que la curarisation pendant une ventilation mécanique de 6h sous sédation doublait l’aire des atélectasies, cet effet étant prévenu par la PEP. Sur poumon préalablement lésé par du Tween, la curarisation n’augmente par contre pas les atélectasies. Il apparait donc qu’à la phase précoce d’une lésion pulmonaire, la curarisation n’ a pas d’effet délétère que la formation d’atélectasies. (Neuromuscular blockade differentially affects size of atelectasis in pig healthy and injured lungs. Antoine Roch, Louis Fouché, Céline Gil, Jean-Marie Forel, Anne-Marie Tasei, Dorothée Blayac, Thierry Fusai and Laurent Papazian. Soumis pour publication).

 

Thème 3 : Optimisation de la prise en charge des infections respiratoires

 

3.1 - Justification

Les pneumopathies nosocomiales acquises sous ventilation mécanique (PAVM) ne concernent que les pneumopathies nosocomiales acquises après 48 heures au moins de ventilation artificielle. La survenue d’une PAVM est le plus souvent la conséquence d’une inhalation microbienne à partir d’une colonisation oro-pharyngée. Une colonisation (présence de germes au niveau de la muqueuse respiratoire sans invasion de cette muqueuse ni réaction systémique) précède quasiment toujours une PAVM. Il n’y a pas de critère absolu permettant de poser le diagnostic de PAVM. Le risque est grand de ne traiter qu’une colonisation. Ceci justifie l’étude de nouveaux critères ou marqueurs de diagnostic. Au plan thérapeutique, des adjuvants au traitement antibiotique peuvent être proposés.

 

3.2 - Place de la procalcitonine sérique et dans le LBA dans le diagnostic des pneumonies acquises sous ventilation mécanique

La détermination du taux de procalcitonine (PCT) permettrait d’une part, un traitement précoce et adapté de l’infection contribuant ainsi à une diminution de la morbidité et de la mortalité, mais il pourrait d’autre part, permettre de réduire la consommation d’antibiotiques avec un double impact économique et épidémiologique en diminuant le risque d’émergence de résistance bactérienne. Nous avons réalisé un travail visant à évaluer l’intérêt du dosage de la PCT au niveau sérique et au niveau du LBA. Nous ne retrouvons aucune différence significative entre la PCT (sang et LBA) des patients présentant une PAVM et ceux n’en présentant pas. L’utilisation de critères cliniques et bactériologiques usuels est plus pertinente (Microbiogical data, but not procalcitonin improve the accuracy of the clinical pulmonary infection score. B. Jung, N. Embriaco, F. Roux, J.M. Forel, D. Demory, J. Allardet-Servent, S. Jaber, B. La Scola, L. Papazian. Intensive Care Medicine in press).

 

3.3 – Biopsie pulmonaire dans le diagnostic étiologique des syndromes de détresse respiratoire aiguë persistants

Les SDRA sont associés à une mortalité d’environ 50%. Une fibrose pulmonaire réversible et cortico-sensible peut en compliquer l’évolution. Cependant cette fibrose est difficile à distinguer d’une pneumonie nosocomiale. Aussi, lorsque le LBA et l’ensemble du bilan infectieux est négatif, notre équipe a proposé la réalisation d’une biopsie chirurgicale chez les patients ventilés de réanimation. Nous rapportons notre expérience à propos de 100 biopsies qui ont montré qu’une fibrose n’était présente que dans 53% des cas mais était associée à une infection contre-indiquant ou différant une corticothérapie dans plus de la moitié de ces cas. De plus, l’obtention d’un résultat contributif de la biopsie, amenant à une modification du traitement, était associée à une augmentation significative de la survie (A contributive result of open-lung biopsy improves survival in acute respiratory distress syndrome patients. Papazian L, Doddoli C, Chetaille B, Gernez Y, Thirion X, Roch A, Donati Y, Bonnety M, Zandotti C, Thomas P. Crit Care Med. 2007 Mar;35(3):755-62).

 

3.4 – Dilution du LBA et cultures quantitatives

La méthode de réalisation des LBA chez les patients ventilés suspects de PAVM n’est pas parfaitement standardisée. Nous avons réalisé un travail où la dilution de chaque LBA était étudiée par la méthode de la dilution de l’urée. 241 LBA ont été analysés. Finalement, la dilution n’a influencée l’interprétation des résultats du LBA que chez 5 patients. Il s’avère donc que l’on peut s’affranchir d’évaluer la dilution du LBA chez les malades suspects de PAVM (Bacterial ventilator-associated pneumonia: bronchoalveolar lavage results are not influenced by dilution. Baldesi O, Michel F, Guervilly C, Embriaco N, Granfond A, La Scola B, Portugal H, Papazian L. Intensive Care Med. 2009 Jul;35(7):1210-5).

 

3.5 - Etiologies des pneumonies post-opératoires

Thématique centrée sur « les défaillances respiratoires en chirurgie thoracique majeure » en particulier de nature infectieuse, en se basant sur le modèle de la chirurgie du cancer du poumon, du cancer de l’œsophage et de la transplantation pulmonaire. Elle est abordée sous différents aspects  à partir de travaux expérimentaux animaux et de recherche clinique :

- Définition les complications respiratoires en chirurgie thoracique (Complications respiratoires de la chirurgie œsophagienne. Michelet P, Blayac D, Forel JM, Helaine A, Perrin G, D’journo XB, Auffray JP. Réanimation 2008 ;17 : 42-49. Complications respiratoires de l’oesophagectomie pour cancer. D’journo XB, Michelet P, Avaro JP, Trousse D, Doddoli C, Giudicelli R, Fuentes P, Thomas P. Rev Mal Resp 2008 ;25 :683-94.  et Rev Mal Respir 2009 ; 26 : e41-51)

- Impact du terrain sur la morbi-mortalité globale (Results and impact of routine assessment of comorbidity in elderly patients with non-small-cell lung cancer aged > 80 years. BREEN D, BARLESI F, ZEMERLI M, DODDOLI C, TORRE JP, THOMAS P, ASTOUL P. Clin Lung Cancer 2007;8:331-4. Pulmonary function tests as a predictor of quantitative and qualitative outcomes after thoracic surgery for lung cancer. Greillier L, Thomas P, Loundou A, Doddoli C, Badier M, Auquier P, Barlési F. Clin Lung Cancer 2007;8:554-61).

- Impact des techniques chirurgicales sur l’incidence des complications respiratoires (Transthoracic esophagectomy for adenocarcinoma of the oesophagus: standard versus extended two-field mediastinal lymphadenectomy. D’journo XB, Doddoli C, Michelet P, Loundou A, Trousse D, Giudicelli R, Fuentes P, Thomas P. Eur J Cardio-thorac Surg 2005; 27: 697–704)

- Impact des traitements néoadjuvants sur l’incidence des complications respiratoires après oesophagectomie. (Indications and outcome of salvage surgery for oesophageal cancer. D'journo XB, Michelet P, Dahan L, Doddoli C, Seitz JF, Giudicelli R, Fuentes PA, Thomas PA. Eur J Cardiothorac Surg. 2008 ; 33:1117-23)

-Impact d’une colonisation microbiologique bronchique pré ou peropératoire sur l’incidence des complications respiratoires. (Airway colonisation and postoperative pulmonary complications after neoadjuvant therapy for oesophageal cancer. D'journo XB, Michelet P, Papazian L, Reynaud-Gaubert M, Doddoli C, Giudicelli R, Fuentes PA, Thomas PA. Eur J Cardiothorac Surg 2008; 33: 444-450 )

- Impact de la réponse inflammatoire périopératoire sur l’incidence et la gravité des complications respiratoires. (An early inflammatory response to esophagectomy predicts the occurrence of pulmonary complications. XB D’journo, P.Michelet, V Marin, D Blayac, F Gaillat, C. Doddoli, P Bongrand, R. Giudicelli, P. Fuentes, P. Thomas.  Eur J  Thor Cardiovasc Surg2010, inpress).

-Evaluation les effets préventifs et curatifs de certaines stratégies ventilatoires (monoxyde d’azote inhalé, ventilation protectrice, ventilation non-invasive) (Inhaled Nitric Oxide Does Not Prevent Pulmonary Edema After Lung Transplantation Measured By Lung Water Content: A Randomized Clinical Study. PERRIN G, ROCH A, MICHELET P, REYNAUD-GAUBERT M, THOMAS P, DODDOLI C, AUFFRAY JP. Chest 2006;129:1024-1030

- Protective Ventilation Influences Systemic Inflammation after Esophagectomy: A Randomized Controlled Study. Michelet P, D'journo XB, Roch A, Doddoli C, Marin V, Papazian L, Decamps I, Bregeon F, Thomas P, Auffray JP. Anesthesiology 2006;105:911-919. - Non invasive ventilation for treatment of postoperative respiratory failure after esophagectomy. Michelet P, D'journo XB, Senaye F, Forel Jm, Perrin G, Auffray JP, Kerbaul F, Thomas P.Br J Surg 2009, 96: 54-60 - Influence de la stratégie analgésique sur la fonction respiratoire après chirurgie thoracique pour lobectomie. MICHELET P, HELAINE A, AVARO JP, GUERVILLY C, GAILLAT F, KERBAUL F, THOMAS P, AUFFRAY JP. Ann Fr Anesth Reanim 2007;26:405-11).

- Evaluation de l’impact d’une prise en charge optimale de la douleur en chirurgie thoracique par une analgésie péridurale dorsale, sur l’incidence des complications respiratoires.(Perioperative Risk Factors for Anastomotic Leakage After Esophagectomy: Influence of Thoracic Epidural Analgesia. Michelet P, D’journo XB, Roch A, Papazian L, Ragni J, Thomas P, Auffray JP. Chest 2005; 128: 3461-3466. - Effect of thoracic epidural analgesia on gastric blood flow after oesophagectomy. Michelet P, Roch A, D'journo XB, Blayac D, Barrau K, Papazian L, Thomas P, Auffray Jp. Acta Anaesthesiol Scand 2007;51:587-94. - Adding ketamine to morphine for patient-controlled analgesia after thoracic surgery: influence on morphine consumption, respiratory function, and nocturnal desaturation. MICHELET P, GUERVILLY C, HELAINE A, AVARO JP, BLAYAC D, GAILLAT F, DANTIN T, THOMAS P, KERBAUL F. Br J Anaesth 2007;99:396-403.

- Impact des transfusions sanguines sur l’incidence et la gravité des complications respiratoires. (Impact of blood transfusions on outcome after pneumonectomy for thoracic malignancies. THOMAS P, MICHELET P, BARLESI F, THIRION X, DODDOLI C, GIUDICELLI R, FUENTES P.  Eur Respir J 2007 ;29 :565-70)

- Diagnostic et traitement des infections respiratoires et thoraciques rares. (Lymph node biopsy specimens and diagnosis of cat-scratch disease. ROLAIN JM, LEPIDI H, ZANARET M, TRIGLIA JM, MICHEL G, THOMAS PA, TEXEREAU M, STEIN A,  ROMARU A, EB F, RAOULT D. Emerg Infect Dis 2006;12: 1338-44.

- A contributive result of open-lung biopsy improves survival in acute respiratory distress syndrome patients PAPAZIAN L, DODDOLI C, CHETAILLE B, GERNEZ Y, THIRION X, ROCH A, DONATI Y, BONNETY M, ZANDOTTI C, THOMAS P. Crit Care Med 2007;35:755-62.

- Necrotizing Fasciitis of the chest wall. Birnbaum D, D’journo XB, Casanova D, Thomas P. Interact Cardiovasc Thorac Surg.2010. Inpress).

- Caractéristiques spécifiques des défaillances respiratoires associées à certaines pathologies ou complications chirurgicales rencontrées en chirurgie thoracique. (Fistules bronchiques post-pneumonectomies : facteurs prédictifs. Yena S, Doddoli C, Doumbia S, D'journo XB, Aragon A, Mondini M, Marghli A, Thomas P, Giudicelli R, Sangare D, Soumare S, Fuentes P. Ann Chir 2006;131:22-6. - Long-Term Observation and Functional State of the Esophagus After Primary Repair of Spontaneous Esophageal Rupture. D’journo XB, Doddoli C, Avaro Jp, Lienne P, Giovannini Ma, Giudicelli R, Fuentes PA, Thomas PA. Ann Thorac Surg 2006, 81: 1858-62)

L’ensemble de cet axe de recherche clinique a été l’occasion d’une reconnaissance locale et régionale par l’attribution par l’Université de la Méditerranée du Trophée de la Santé 2009 dans la section Recherche Médicale, et Européenne (ESTS Brompton prize) récompensant la meilleure communication scientifique de l’European Society of Thoracic Surgery en 2009 (Récipiendaire : XB D’Journo).

 

3 -.Travaux en cours et projets


Axe 1 : Identification de nouveaux agents de pneumonies

 

1.1 - Détection de nouveaux agents de pneumonies nosocomiales par métagénomique différentielle

Plus de 100 agents pathogènes bactériens, viraux, parasitaires ou fongiques ont pu être associés à des tableaux de pneumonies au cours de ces dernières années. Nous avons pu, ces dernières années, identifier dans notre groupe ou en collaboration, plus de 50 nouveaux agents pathogènes (rares ou fréquents) pour l’homme. L’approche que nous avons utilisée, depuis 1993, pour mettre en évidence ces nouveaux pathogènes est basée sur une stratégie comportant des prélèvements réalisés dans un cadre nosologique précis, des techniques de culture atypiques (parmi lesquelles les amibes de l’eau utilisées pour isoler des pathogènes intra-cellulaires), des moyens d’identifications moléculaires modernes (utilisation l’amplification et le séquençage de gènes conservés 16S rRNA, rpoB) mis en place grâce au financement d’un séquenceur automatique par le premier PHRC de 1992 et la sérologie utilisant les bactéries isolées dans l’environnement des patients pour étudier la prévalence des anticorps spécifiques. Toutefois, la cause des pneumonies graves nosocomiales reste inconnue dans plus de 30 % des cas, en dépit d’investigations extrêmement poussées. Dans le projet actuel, nous proposons d’amplifier les techniques utilisées pour détecter les agents inconnus de pneumonies. Dans un premier temps nous testerons de façon exhaustive l’ensemble des agents pathogènes respiratoires connus, par culture, sérologie et PCR. Ensuite nous appliquerons sur les prélèvements de patients sans étiologie une méthode mise au point pour étudier les microorganismes non cultivables dans l'environnement : la métagénomique. Cette méthode consiste à séquencer tous les acides nucléiques (de type ADN) obtenus de l’environnement dans des prélèvements d’eau ou de terre. Dans le présent travail, tous les brins d’ADN mais aussi (après action d’une DNASE et d’une enzyme de transcriptase inverse), les ARN présents dans les prélèvements seront séquencés. Cette approche est la seule qui devrait pouvoir permettre d’identifier des micro-organismes eukaryotes, (par élimination des gènes de l’hôte) les prokaryotes (bactéries et archae) et les virus à ADN et à ARN.

 

1.2 - Détection de nouveaux agents de pneumonies post-opératoires

Dans le cadre d’une thèse d’Université (Doctorant 3eme année: Xavier Benoît D’Journo), nous contribuons à la mise en place d’outils modernes et rapides de détection per et postopératoire de colonisations bronchiques par des méthodes de biologie moléculaire de type PCR. Ce travail devrait permettre d’identifier et donc de traiter précocement les complications de nature initialement ou secondairement infectieuses associées à cette chirurgie lourde. Dans le cadre de la recherche clinique, nous pourrions aussi proposer une modification des stratégies d’antibiothérapies prophylactiques. Le prolongement de ce travail sera enfin de développer des outils simples et de pratique courante, permettant une  détection et une identification précoce des germes impliqués dans les pneumonies infectieuses associées à la chirurgie. Par ailleurs, l’unité mixte de recherche CNRS-UMR 6236 dispose d’un plateau technique unique permettant d’envisager des études plus complexes sur la place des colonisations virales (Virus de la mosaïque de la plante du Tabac) et l’oncogenèse des cancers broncho-pulmonaires qui est un axe que nous envisageons d’approfondir.

 

1.3 - Détection de nouveaux agents spécifiques des pneumonies des patients sous assistance respiratoire extra-corporelle (AREC)

Une étude exhaustive (cultures, PCR) des microorganismes retrouvés dans les LBA des patients suspects de PAVM au cours des AREC comparée à des patients présentant un SDRA mais ne nécessitant pas d’AREC permettra de comparer l’écologie microbienne et d’évaluer s’il y a des différences. Ces différences sont susceptibles d’exister en raison de la sévérité différente de la détresse respiratoire.

 

Axe 2 : Modèles expérimentaux de pneumonie

 

2.1- Inhalation de dérivés aminostéroïdiens pour le traitement d’infections pulmonaires à Pseudomonas Aeruginosa

Les pathologies respiratoires chroniques telles que la mucoviscidose sont la source d’inflammation et d’infection broncho-pulmonaieres, notemment à Pseudomonas aeruginosa. Une des approches thérapeutiques consiste à l’administration d’antibiotiques par voie inhalée. Après avoir synthétisé de nouveaux dérivés aminostéroïdiens possédant une activité antimicrobienne, nous testons ces molécules dans un modèle de pneumonie chronique à Pseudomonas aeruginosa inclus dans des billes d’agar chez le rat, qui comporte des similitudes avec les infections  observées lors de la mucoviscidose. Après administration trachéale d’une solution de Pseudomonas aeruginosa dans des billes d’agar, le développement d’une pneumonie est observé plusieurs jours, sans ou avec traitement inhalée répété par aminostéroïdiens. L’objectif principal est la quantification bactérienne en culture sur tissu pulmonaire prélevé après euthanasie. Ce travail est en cours de réalisation, le modèle étant mis au point et les groupes  contrôles réalisés.

 

2.2 - Effets des gaz halogénés sur la clairance alvéolaire et l’oedème pulmonaire dans un modèle murin de pneumopathie à Pseudomonas aeruginosa.

Les gaz halogénés induisent l’anesthésie générale par des mécanismes impliquant notamment la modulation de canaux ioniques neuronaux. Cependant, leurs effets ne sont pas limités aux neurones. Les pneumocytes contribuent à la sécheresse alvéolaire en créant un gradient ionique, principalement de sodium, à travers des canaux apicaux et une pompe NaKATPase dépendante basale. Pendant l’anesthésie générale, l’épithélium alvéolaire est directement exposé aux gaz halogénés. On sait peu de leurs effets sur la capacité de l’épithélium à résorber le liquide alvéolaire. Ceci est intéressant dans la mesure où des patients présentant un oedème pulmonaire ou étant à risque d’oedème sont susceptibles de subir une anesthésie avec inhalation d’halogénés. Chez le rat à poumons sains, les halogénés diminuent de manière réversible la clairance liquidienne alvéolaire, le transport de sodium sensible à l’amiloride et l’activité de la Na/K ATPase (Rezaiguia-Delclaux 1998). Par contre, ces effets n’ont pas été retrouvés chez le lapin à poumons sains (Nielsen 2000). Dans un travail récent (Roch 2006), nous avons montré par contre que les gaz halogénés activent le transport sodique sensible à l’amiloride à travers la membrane apicale de pneumocytes humains en culture. Cet effet est lié à une interaction directe entre ces agents lipophiles et la membrane cellulaire. Les effets des halogénées sur l’épithélium alvéolaire lésé ne sont pas connus. Le but de ce travail sera d’évaluer les effets de l’inhalation d’halogénés sur la clairance et l’oedème alvéolaires dans un modèle murin de pneumopathie à P Aeruginosa. Ce travail sera l’occasion de la mise au point d’un modèle murin de pneumopathie infectieuse, tel que décrit précédemment par d’autres équipes (Robriquet 2006). Induction chez des rats Sprague-Dawley d’une pneumopathie par instillation trachéale sous courte anesthésie d’une suspension de Pseudomonas aeruginosa. Deux heures après l’instillation, anesthésie générale et mise en place d’une ventilation mécanique après trachéotomie. Mise en place d’un cathéter carotidien permettant la mesure continue de la pression artérielle et l’analyse séquentielle des gaz du sang. Des mesures de la clairance alvéolaire seront réalisées chez les animaux contrôles ou après inhalation d’halogénés (halothane ou sevoflurane) à une concentration variable et pour une durée variable randomisée selon les groupes. Pour la mesure de la clairance alvéolaire, 3 ml/kg d’une solution d’albumine seront instillés dans le poumon gauche en 2 minutes. La clairance sera calculée par le ratio de la concentration finale alvéolaire d’albumine divisée par la concentration initiale. En fonction des effets des halogénés sur la clairance, des inhibiteurs et des activateurs spécifiques des différentes composantes du transport liquidien alvéolaire (amiloride, béta-agonistes, ouabaine….) seront administrés préventivement par voie intra trachéale afin de préciser les mécanismes de l’action des halogénés sur ce transport. L’eau pulmonaire extra vasculaire sera mesurée par méthode gravimétrique sur le poumon droit après euthanasie. Un lavage broncho-alvéolaire sera réalisé pour analyse de la cellularité et mesures de la concentration alvéolaire en cytokines pro et anti-inflammatoires.

 

2.3 - Modèle murin de pneumonie chronique à Pseudomonas aeruginosa PAO1 et aérosolisation d’antibiotique

1ère phase : mise au point du modèle :

Caractérisation du modèle de pneumonie d’après des critères physiopathologiques, évolutifs, bactériologiques, histologiques et lésionnels (critères de dommages pulmonaires : Elastase (Aerosolized Prolastin Suppresses Bacterial Proliferation in a Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Lung Infection ANDRÉ M. CANTIN and DONALD E. WOODS AM J RESPIR CRIT CARE MED 1999;160:1130–1135.), surfactant, RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-Products Is a Marker of Type I Cell Injury in Acute Lung Injury Tokujiro Uchida,et al. Am J Respir Crit Care Med Vol 173. pp 1008–1015, 2006).… poids du poumon, réponse inflammatoire associée) et détermination des modalités thérapeutiques (date de début du traitement, durée, posologie, taille des particules).

1/ détermination de la technique d’inoculation bactérienne (bactéries incluses dans des billes d’Agar (Cash HA, Woods DE, McCullough B, Johanson WG Jr, Bass JA. A rat model of chronic respiratory infection with Pseudomonas aeruginosa. Am Rev Respir Dis. 1979;119(3):453-9) - constitution d’une pneumonie chronique (cultures positives stables de 48 h à 7 j post-inoculation) (Aerosolized Prolastin Suppresses Bacterial Proliferation in a Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Lung Infection ANDRÉ M. CANTIN and DONALD E. WOODS, AJRCCM  1999) caractérisée par sa reproductibilité interindividuelle en terme d’objectifs microbiologiques, sa tolérance clinique suffisante pour maintenir les animaux vivants et autonomes pendant la durée du suivi thérapeutique.

2/ Mise au point du traitement aérosolisé: inefficacité d’un aérosol unique de 285 µg de NV503 (Lavigne JP, Brunel JM, Chevalier J, Pagès JM. Squalamine, an original chemosensitizer to combat antibiotic-resistant gram-negative bacteria. J Antimicrob Chemother. 2010;65(4):799-801) administré pendant 30 minutes à 48 h de l’inoculation ou de Colimycine 1M d’UI selon les mêmes modalités.Amélioration de la technique d’aérosolisation grâce à l’acquisition d’un système validé (Elastase- and LPS-exposed mice display altered responses to rhinovirus infection Sajjan et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2009; 297: L931-L944) (ANNEXE) multiport et adaptable à la souris. Projet D’achat de matériel : Modular device for precision inhalation exposure (InExpose SCIREQ Inc Montréal Canada), montant HT 15 000 Euros

Recherche de l’efficacité microbiologique d’un traitement aérosol (Equipe JM Rolain)

2ème phase :

Etude1 description du modèle de pneumonie infectieuse:

5 Groupes de 5-10 animaux

- G1 Inoculation avec des billes d’AGAR en suspension mais non infectées

- G2 Inoculation avec des billes d’AGAR (taille) infectées (concentration) sacrifié à 5 Jours

- G3 Inoculation infectieuse –sacrifice à 7 jours

- G4 Inoculation infectieuse –sacrifice ou décès spontané ou si survie à J28

- G5 Contrôle

 

Critères d’évaluation : Mortalité, Paramètres physiologiques : animal vigile : poids, température, comportement, hématose. Animal sacrifié : mécanique ventilatoire. Poumon : poids du poumon, Histologie morphologique : score d’extension et d’intensité de la pneumonie (Dr Lepidi)( Montgomery et al. Comparison of Virulence in Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Pulsotypes USA300 and USA400 in a Rat Model of Pneumonia C P. The Journal of Infectious Diseases 2008; 198:561–70.). Immuno-hostochimie pulmonaire (récepteurs membranaires, moléculaes d’adhésion). Réponse de l’Hôte: cytokines pulmonaires (Lavage alvéolaire, extraits tissulaires), recrutement de cellules inflammatoires (Activité myéloperoxydase, compte des leucocytes dans le lavage alvéolaire). Marqueurs biochimiques de dommage pulmonaire dan le lavage alvéolaire (RAGE, ELASTASE, Surfactant), Réponse systémique et infectioeuse à distance (hémocultures, cytokines plasmatiques, prélèvements foie-reins…)

Critères microbiologiques : localisation par histo-morpho des colonies / abcès

Culture de broyats tissulaires (poumon autres organes)

Etude 2 : traitement aérosol de la pneumonie infectieuse à Pseudomonas aeruginosa PAO1

4 groupes de 5-10 animaux exploitables

G1 : Pneumonie à Pseudomonas aeruginosa PAO1 par inoculation de boilles d’AGAR (cf ci-dessus) + traitement bi-quotidien de 11,4 mg de NV503 pendant  5 j débuté à 48h post-inoculation

G2 : débuté le jour de l’inoculation

G3 : pneumonie + traitement IV débuté à 48h post-inoculation

G4 : pneumonie + traitement IV débuté je jour de l’inoculation

Critères d’évaluation : mortalité spontanée, critères physiologiques, histologie, dosages pharmacologiques, culture tissulaire

 

2.4 – Neuro-immunomodulation de la réponse inflammatoire induite par une pneumonie chronique à Pseudomonas aeruginosa PAO1

Le système neurovégétatif vagal produit des neurokinines (afférences) et de l’acétylcholine (efférences). Un effet protecteur d’un traitement par  inhibiteur des récepteurs de la neurokinine substance P (SP) (neuromédiateur à propriétés vasodilatatrices et proinflammatoires) a été démontré dans un modèle de pneumonie non infectieuse. (Brégeon F, et al. Substance P receptor blockade decreases stretch-induced lung cytokines and lung injury in rats. J Physiol. 2010, 588(Pt 8):1309-19). Par ailleurs, l’activation cholinergique spécifique des récepteurs nicotiniques alpha 7 (alpha 7nAchR) administrés par voie intraveineuse protège vis-à-vis des lésions de pneumonie bactérienne Gram – (Xiao Su, Michael A. Matthay and Asrar B. Malik Requisite Role of the Cholinergic alpha 7 Nicotinic Acetylcholine Receptor Pathway in Suppressing Gram-Negative Sepsis-Induced Acute Lung Inflammatory Injury J. Immunol. 2010;184;401-410).

L’efficacité par voie inhalée de ces agents thérapeutiques sera testée dans le modèle de pneumonie à Pseudomonas aeruginosa.

4 groupes d’animaux

G1 pneumonie à pseudomonas

G2 pneumonie à pseudomonas + Aerosols de SP antagoniste (NK-1 R antagonist)

G3 pneumonie à pseudomonas + SP antagoniste (NK-1 R antagonist)  intrapéritonéal

G4 pneumonie à pseudomonas + PNU aérosol

G5 pneumonie à pseudomonas + PNU intrapéritoneal

Critères dévaluation

Idem ci-dessus + SP pulmonaire par MALDI-TOF (Equipe Sabatier, ingenierie des protéines U2)

 

2.5 - Modèle murin de pneumonie infectieuse aiguë

Transposition au rat du modèle de pneumonie par inhalation de liquide gastrique humain précédemment développé chez le lapin (Role of proinflammatory activity contained in gastric juice from intensive care unit patients to induce lung injury in a rabbit aspiration model. Brégeon F, Papazian L, Delpierre S et al. Crit Care Med. 2008;36(12):3205-12/ Allardet-Servent J, Bregeon F, Delpierre S et al.  High-frequency percussive ventilation attenuates lung injury in a rabbit model of gastric juice aspiration. Intensive Care Med. 2008;34(1):91-100./ Fraisse A, Bregeon F, Delpierre S,et al. Hemodynamics in experimental gastric juice induced aspiration pneumonitis. Intensive Care Med. 2007;33(2):300-7.)

Caractérisation du modèle chez le rat (mécanique pulmonaire, fonction d’échanges gazeux, inflammation pulmonaire et systémique, histopathologie (Dr H LEPIDI)

1ere partie in vitro (collaboration : Pr J Pugin, Hop Universitaire Genève) :

Etude du pouvoir cytotoxique et pro-inflammatoire du liquide gastrique humain prélevé sur des malades de réanimation dans les premières 24heures d’une détresse respiratoire, sans adjonction d’anti-acides. Détermination d’un pouvoir pro-inflammatoire des liquides gastriques sur des cultures de pneumocytes (A549 cells) caractérisé par la production d’ICAM, en fonction de la dilution. Recherche du rôle des cytokines TNF et IL1 par adjonction d’antagonistes de ces cytokines dans la culture.

2eme partie In vivo (MASTER M2 2010-2011, F Xéridat)

Vérification du rôle clé de l’IL-1 dans la pnaumonie par inhalation de liquide gastrique humain

4 groupes de rats anesthésiés ventilés en ventilation protectrice

G1 inhalation de liquide gastrique humain

G2  inhalation d’acide chlorhydrique (HCl) de pH tamponné identique à celui du liquide gastrique

G3 inhalation de sérum salé

G4 groupe de référence ventilé sans inhalation

G5 groupe protégé par administration d’IL1-ra (antagoniste des récepteurs de l’IL1)

Critères d’évaluation :

Mortalité spontanée, Suivi continu :paramètres cardio vascilaires généraux, échanges gazeux, mécanique ventilatoire

Lésions pulmonaires : histologie morphologique (D Lepidi), poids du poumon

Réponse inflammatoire : Myeloperoxydase pulmonaire, cytokine IL-1 pulmonaire et systémique

 

2.6 - Pneumonie bactérienne aiguë : interactions avec la ventilation mécanique

La ventilation artificielle favorise la colonisation et l’infection pulmonaire. Les interactions en l’agression mécanique et l’agression infectieuse peuvent mettre en jeu des modifications des systèmes infectants du micro-organisme ainsi que des systèmes de défense de l’hôte. Ces interactions seront étudiées dans le modèle de pneumonie à pseudomonas aeruginosa.

Mise au point du modèle de pneumonie infectieuse ventilée :

Définition de la séquence d’agression et le choix des modalités ventilatoires permettant la mise en évidence d’une potentialisation sur les altérations fonctionnelles pulmonaires et/ou les réponses inflammatoires associées et/ou les critères infectieux tissulaires (Kurahashi, et al. Effect of lung protective ventilation on severe Pseudomonas aeruginosa pneumonia and sepsis in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 287: L402–L410, 2004. / : Brégeon F, et al. Mechanical ventilation affects lung function and cytokine production in an experimental model of endotoxemia. Anesthesiology. 2005;102(2):331-9/ Brégeon F, et al. Persistence of diaphragmatic contraction influences the pulmonary inflammatory response to mechanical ventilation. Respir Physiol Neurobiol. 2004;142(2-3):185-95. / Brégeon F, Roch A, et al. Conventional mechanical ventilation of healthy lungs induced pro-inflammatory cytokine gene transcription. Respir Physiol Neurobiol. 2002 Aug 30;132(2):191-203. ).

Critères d’évaluation

Survie

Paramètres généraux hémodynamiques

Cultures sur tissu pulmonaire

Cultures de tissus extra pulmonaires

Critères d’histologie morphologique

Immuno-histochimie pulmonaire (expression de molécules d’adhésion, récepteurs membranaires)

ARNm : voies de signalisation conduisant à la production de cytokines (NFkB, Kinases),

Activation leucocytaire,

Metagenomique bactérienne

Achat d’équipement pour la ventilation et les mesures physiologiques cardio-respiratoires du rat ventilé :

- Respirateur pour petit animal : FlexiVent TM , SCIREQ Inc, Montréal, Canada.

(Contribution of alveolar macrophages to the response of the TIMP-3 null lung during a septic insult. Martin EL, et al.. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007 Sep;293(3):L779-89)

- Perfuseur pour petit animal plage 1 µl/H – 10 ml/min : ALADDIN2-220 1.00 2392.50 2392.50 2 Programmable Syringe Pumps : 1400 Euros

- Matelas chauffant asservi à la Temprature centrale: ATC1000 1.00 1377.50 1377.50 Animal Temperature Controller w/rectal probe, 2014.35 EUROS HT

- Lunettes pour microchirurgie Surgical Eye Loupe 6.0x (STP-6.0X), New York Microscope Company Inc. 1000 Euros HT

 

Axe 3 : Optimisation de la prise en charge des infections respiratoires

 
3.1 - Statines et mortalité des pneumonies acquises sous ventilation mécanique (étude clinique)

Les statines inhibent l’HMG-CoA reductase. Elles ont été largement étudiées dans l’athérosclérose, maladie inflammatoire de l’endothélium vasculaire, partageant de nombreuses similitudes physiopathologiques avec le sepsis.  Des données très récentes tirées d’études animales et de modèles humains de sepsis suggèrent que les statines pourraient être bénéfiques dans la modulation de la réponse inflammatoire liée au sepsis. Les statines exercent un effet anti-inflammatoire en modulant la réponse des monocytes et des lymphocytes T en modifiant leurs interactions avec l’endothélium. Les statines modifient aussi l’expression de gènes de l’inflammation, aboutisant à une réduction de la production de cytokines. Il s’y associe une action anti-oxydante et des propriétés anti-thrombotiques ainsi qu’une inhibition de l’expression des antigènes du système majeur d’histocompatibilité de type II. Ainsi, toutes ces actions sont potentiellement d’intérêt au cours du sepsis. Les données cliniques sont peu nombreuses. Aucune étude contrôlée n’a été conduite. Les statines pourraient représenter un nouvel atout thérapeutique dans la prise en charge de ces pneumonies. Nous avons donc conçu une étude multicentrique randomisée, contrôlée, en double-insu, statine versus placebo visant à évaluer l’impact sur la mortalité associée aux PAVM. Ce travail multicentrique (46 centres) a reçu le concours financier d’un PHRC national (2007). Il vient de débuter. Deux études ancillaires sont associées : 1°) la pharmacocinétique de la simvastatine orale chez le malade ventilé et 2°) l’évaluation de modifications du système immunitaire induites par les statines au cours des PAVM.

 

3.2 – Epidémiologie des pneumonies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) au cours du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA)

Les PAVM peuvent compliquer l’évolution du SDRA. Très peu de travaux prospectifs ont évalué leur incidence ainsi que l’impact sur la mortalité du SDRA. Une étude ancillaire du PHRC ACURASYS consiste à prospectivement l’épidémiologie des PAVM bactériennes au cours du SDRA. Trois-cent quarante patients inclus pourront ainsi être évalués. L’hypothèse est que les PAVM ne modifient pas le pronostic des PAVM. Le diagnostic microbiologique sera établi au moyen de LBA sous fibroscopie ainsi que de prélèvements distaux protégés.

 

3.3 – Etude de la pathogénicité du Cytomegalovirus chez les patients ventilés

Nous avons mis en évidence l’existence d’authentiques pneumonies à Cytomegalovirus à partir d’examens histologiques pulmonaires obtenus par biopsie chez des malades sous ventilation mécanique. L’impact réel des infections actives à CMV acquises sous ventilation mécanique n’a cependant été que peu étudié. L’objectif principal de cette étude sera de mettre en évidence une augmentation du nombre de jours vivants sans ventilation mécanique des patients ventilés présentant une antigénémie positive (au moins une cellule) traités par Gancyclovir par comparaison à des patients ventilés présentant une antigénémie positive recevant un placebo. Il s’agira d’une étude multicentrique incluant 250 patients. Les principaux objectifs secondaires seront la mortalité à J60 et le pourcentage de pneumonies à CMV (LBA positif en culture ou par PCR avec un tableau radio-clinique) dans chacun des deux groupes.

 

3.4 – Colonisation bronchique en chirurgie thoracique (modèle du cancer du poumon)

L’objectif primaire de l’étude est de décrire de façon prospective, par prélèvements systématiques au niveau de l’arbre respiratoire, différents pathogènes (bactériens ou non bactériens) colonisant l’arbre respiratoire au moment de la chirurgie.  Cette recherche mettra en œuvre des outils originaux d’isolement et de culture d’une part, de détection et d’identification moléculaire d’autre part des agents potentiellement colonisant au niveau bronchique (LBA) mais aussi parenchymateux (biopsie pulmonaire). L’objectif secondaire est de développer des outils moléculaires spécifiques de détection rapide de ces pathogènes (rtPCR) et donc de dépister précocement ces colonisations pour pouvoir les traiter de façon adaptée, l’objectif étant de développer un kit de détection rapide en extemporanée ou POC (point-of-care). Enfin, un des but ultime de cette recherche est de favoriser la découverte de germes émergents puisque détectés de manière innovante et moderne. 

 

3.5 – Etude prospective randomisée sur l’intérêt d’une décontamination oro-pharyngée en chirurgie d’exérèse broncho-pulmonaire pour cancer

Le but de cette étude prospective et randomisée est d’évaluer l’intérêt d’une décontamination oro-pharyngée en préopératoire sur la réduction des complications respiratoires  postopératoires (pneumopathie nosocomiale, SDRA) et sur la mortalité hospitalière. L’étude inclura la réalisation de prélèvements microbiologiques étagés au niveau de l’arbre respiratoire (parenchyme et bronches).

 

3.6 – Colonisation bronchique à Cytomegalovirus des patients proposés pour une chirurgie d’exérèse pulmonaire

Etude prospective et observationnelle. Collections de biopsies pulmonaires et de sérums réalisés au moment de la chirurgie avec recherche spécifique du CMV (antigénémie pp65, sérologie IgG et IgM, PCR virus CMV) dans le poumon et le sang (préopératoire et postopératoire). Le but est de caractériser l’existence de réactivation ou d’infection au moment de la chirurgie. L’autre aspect est celui de caractériser la participation des lymphocytes NK dans ces mêmes prélèvements vis-à-vis du CMV.

 

3.7 – Interaction cancer du poumon et virus de la mosaïque de la plante de tabac

L’objectif est de mettre en évidence l’existence et la présence d’ADN viraux issus de la plante du tabac dans le parenchyme pulmonaire des patients tabagiques et présentant un cancer du poumon opéré. La méthodologie inclura : immunohistochimie sur pièce opératoire (poumon sain et tumoral) et sérologie des patients opérés. 


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