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Microbiologie & Sciences Humaines

Equipe n°4: Bernard La Scola, PU-PH

Microorganismes de l’environnement, pneumonies et bioterrorisme

 

 

Composition de l’équipe

 

  1. Bernard LA SCOLA, PU-PH, HDR
  2. Yvon BERLAND, PU-PH, HDR
  3. Philippe COLSON, MCU-PH
  4. Hubert LEPIDI, MCU-PH, HDR
  5. Valérie MOAL, PH
  6. Isabelle PAGNIER, post-doctorante

 

Les travaux de cette équipe se concentrent sur l’analyse des nouveaux virus géants de l’environnement et de l’alimentation, de leur écologie à leur étude génétique, et de leur implication potentielle en pathologie humaine. A la frontière de ces travaux, nous travaillerons sur la recherche et l’analyse de nouveaux agents viraux chez l’immunodéprimé. L’analyse se fera selon les 4 axes de recherche de l’équipe à savoir la recherche des virus géants et des petites bactéries intracellulaires de protozoaires dans l’environnement, la génétique de ces virus géants et de ces bactéries, leur rôle potentiel en pathologie humaine et enfin la recherche et l’analyse de virus émergents en pathologie humaine chez l’immunodéprimé.

 

Projet 1. Isolement et caractérisation préliminaires de virus géants et de leurs partenaires chez les protozoaires (BL, IP)

 

            L’axe principal de l’équipe continuera à être la recherche de nouveaux agents environnementaux, essentiellement bactéries et virus associés aux protozoaires. Tout d’abord, la poursuite de la recherche de ces nouveaux agents se fera en élargissant les environnements testés et les supports pour les isoler. Jusqu’à maintenant nous avons recherché ces agents quasi exclusivement dans l’eau et en utilisant comme support les amibes du genre Acanthamoeba. La méthode utilisée a été très efficace puisqu’elle a permis d’isoler des nombreux nouveaux agents viraux et bactériens [Pagnier I, et al. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. 2008. Environ Microbiol. 10:1135-1144; La Scola B et al. The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus. 2008. Nature. 455:100-104 ; Pagnier I et al. 2009. Emerging Mycobacteria spp. in cooling towers. Emerg Infect Dis. 15:121-122; Evstigneeva A et al. 2009. Amoeba co-culture of soil specimens recovered 33 different bacteria, including four new species and Streptococcus pneumoniae. Microbiology. 155:657-664; Boyer M et al, 2009. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:21848-53; La Scola B et al, 2010. A burden of new giant viruses from the environment and their tentative characterization by MALDI-TOF mass-spectrometry. Intervirology. 53(5):344-53.].

Les nouveaux environnements testés seront les divers environnements humains notamment sols et aliments, végétaux et animaux. Nous testerons aussi les prélèvements humains souvent colonisés par des amibes, notamment les lentilles ou liquides de lentilles provenant de patients victimes de kératites. Pour ce qui est des supports de culture, nous allons ajouter aux amibes du genre Acanthamoeba d’autres protozoaires susceptibles de servir de support de culture à ces nouveaux agents, par exemples ciliés et flagellés, mais aussi algues. A côté des protozoaires que nous avons commencé à cultiver dans le laboratoire après les avoir commandé dans des collections de cultures de microorganismes, nous utiliserons aussi des protozoaires que nous avons déjà isolés ou que nous isolerons nous même. Afin d’améliorer nos techniques d’isolement qui demandent de longues manipulations, nous sommes actuellement en train de préparer des systèmes de culture à haut débit par co-inoculation sur gélose. En effet, la procédure actuelle utilisant un milieu liquide avec différents antibiotiques est efficace mais fastidieuse car elle nécessite de réaliser de nombreuses colorations pour objectiver la pousse éventuelle d’un agent microbien. En parallèle à une meilleure préparation du prélèvement par filtrations successives, nous allons inoculer nos prélèvements en gélose sur des tapis non confluents d’amibes. Cela permettra d’objectiver la présence d’un agent pathogène pour les amibes par simple examen macroscopique des géloses selon une méthode comparable à celle que nous avions développé pour étudier les pouvoir pathogène de différentes souches de P. aeruginosa sur les amibes (Fenner L et al, Are clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa more virulent than hospital environmental isolates in amebal co-culture test?, Crit Care Med. 2006 34:823-8). Ce système d’isolement sur Acanthamoeba est en fin de développement et prêt à être utilisé, pour les autres protozoaires il reste à développer. Cette partie du travail d’isolement sera réalisée uniquement par notre équipe et sera coordonnée par notre post-doctorant I. Pagnier (prévue pour un poste de MCF). Elle encadrera avec B. La Scola une équipe de 3 thésards. Le premier thésard aura en charge la mise au point de la culture sur les protozoaires autres que les amibes du genre Acanthamoeba et la caractérisation préliminaires des microorganismes isolés dans ce cadre. Un second thésard aura en charge les isolements à haut débit sur les amibes Acanthamoeba et de même la caractérisation préliminaire des microorganismes isolés dans ce cadre. Originaire de Tunisie, ce thésard qui réalisera sa thèse en co-tutelle avec notre école doctorale étudiera en outre divers prélèvements environnementaux de son pays d’origine.

 

Projet 2. Analyse du génome de virus géants et des bactéries intracellulaires de protozoaires (BL, PC)


Après avoir isolé ces nouveaux agents nous étudierons leur génétique. Les souches de virus et de bactéries apparaissant comme complètement nouveaux après la première caractérisation (microscopie électronique, séquence d’un ou deux gènes conservés, Maldi-Tof MS directe) seront analysées par séquençage complet du génome. P. Colson qui est actuellement en stage post-doctoral dans le laboratoire d’E. Koonin à Bethesda au NIH pour analyse bioinformatique des génomes viraux et sera le responsable sur ce champ. Il poursuivra son travail en collaboration avec les équipes de E. Koonin au NIH et avec les autre bioinformaticiens de l’URMITE. B. La Scola continuera à être responsable de l’analyse génomique des nouveaux agents bactériens originaux que nous découvrirons et séquencerons. Pour les agents les plus originaux, nous irons plus loin dans l’étude de leur écologie et de leur mode de vie, notamment en étudiant leur mode de multiplication dans les amibes par analyse en microscopie électronique et confocale. Pour ce mêmes agents nous analyserons les processus de multiplication les plus originaux par microarrays afin d’étudier les gènes activés aussi bien chez l’amibe que chez le microorganisme au cours de l’infection et du cycle de multiplication. Un autre thésard sous la direction de P. Colson sera directement en charge de ce travail.

 

Projet 3. Analyse du rôle des virus géants en pathologie humaine (BL, HL)


Pour ce qui est des infections chez l’homme, la recherche de l’implication des virus géants anciens et nouveaux ainsi que les bactéries intracellulaires d’amibes se fera par 2 approches différentes. Une première approche sera basée sur la réalisation d’études séro-épidémiologiques à haut débit par technique ELISA en utilisant les diverses espèces virus géants comme antigène. Le laboratoire de l’URMITE possède d’importantes collections de sérums classés par grands syndromes (pneumonies, meningoencéphalites, endocardites, gastroentérites, fièvres éruptives, adénopathies,…) qui seront testées de façon sériées. La seconde approche sera plus ciblée, visant à détecter par PCR à l’aide de systèmes d’amorces basées sur les études des génomes l’ADN des ces virus dans des prélèvements cliniques (essentiellement dans le cadre de pneumonies et de diarrhées ou orientés par les études séro-épidémiologiques précédentes). Pour finir, les prélèvements cliniques détectés positifs seront inoculés en co-cultures avec des protozoaires. H. Lépidi sera en charge des analyses d’anatomo-pathologie avec immunohistochimie sur les prélèvements biopsiques de patients positifs. Spécifiquement pour les gastroentérites, nous nous appuierons sur la Fédération de microbiologie de l’hôpital de la Timone à Marseille qui reçoit plus de 20 selles de patients diarrhéiques par jour et sur nos collaborations outre-mer, notamment avec la composante IRD de notre unité qui pourra nous donner accès à des selles de patients du Sénégal. Un travail préliminaire sur un échantillon de selle d’un patient du Sénégal a permis l’isolement du premier virus géant chez l’homme.

 

Projet 4. Virus émergents de l’environnement et pathologie de l’immunodéprimé (PC, VM, YB)

 

L’aspect suivant du projet concernant les virus émergents s’intéressera aux virus de plantes et sera coordonné par P. Colson. Un travail récent de métagénomique a montré que la majorité des virus à ARN présents dans le tube digestif humain étaient des virus du piment (pepper mild mottle virus (PMMoV)) retrouvés infectieux et à des titres très élevés. D’autres études ont montré que l’administration par voie orale de virus de plantes induisait une réponse immune chez des souris, et certains virus de plantes ont pu être cultivés sur des lignées cellulaires humaines et détectés dans des organes de souris après inoculation par voie orale ou systémique. De plus, l’implication possible de virus de plantes dans des maladies chez l’homme a été discutée il y a plusieurs décennies. En effet, des virus de la mosaïque du tabac, qui sont comme le PMMoV des virus extrêmement résistants du genre Tobamovirus, ont pu être recouvrés de prélèvements respiratoires de patients avec antécédents de pneumopathie et de cancer du poumon. Dans un premier travail, nous avons détecté par PCR du PMMoV dans plus de la moitié des produits alimentaires à base de piment que nous avons testé. Nous avons montré que le PMMoV était infectieux par inoculation à des plantes sensibles ; de plus, nous avons confirmé que ce virus peut être présent dans le tube digestif humain puisque nous l’avons détecté dans les selles de 7% des patients adultes [Colson P et al. Pepper mild mottle virus, a plant virus associated with specific immune responses, fever, abdominal pains, and pruritus in humans. Plos One 2010, 5:e100410]. Parallèlement, nous avons observé chez des patients porteurs de PMMoV dans les selles une réponse anticorps spécifique dirigée contre le virus, et une étude cas contrôle a retrouvé que la présence de PMMoV était significativement associée à de la fièvre, des douleurs abdominales et un prurit. L’ensemble de ces données suggère l’intérêt de réévaluer la relation et le rôle pathogène des virus de plantes chez l’homme et l’animal. Nous allons poursuivre nos travaux sur les Tobamovirus en analysant la prévalence et la persistance de ces virus dans différents prélèvements, tissus et organes, provenant de patients, ou d’animaux après inoculation expérimentale. Pour la partie concernant les patients, nous étudierons notamment avec Y. Berland et V. Moal une file active de personnes transplantées du rein. Actuellement un PHRC interrégional vise à déterminer l’incidence de Virus de l’Hépatite E (VHE) et du PMMoV dans les selles de patients transplantés de rein ou de foie, à déterminer l’impact clinique de ces virus, les facteurs de risque associés à leur présence et de caractériser les virus identifiés par séquençage, culture et microscopie électronique. Nous étudierons également les réponses immunes spécifiques dirigées contre des protéines virales. Parallèlement, nous allons mettre en place des systèmes de cultures des Tobamovirus sur plantes sensibles et sur cultures cellulaires de lignées humaines ou animales, et allons étudier les interactions entre ces virus et les cellules humaines ou animales.

La dernière partie de ce travail concernera plus généralement la recherche et l’analyse de virus émergents en pathologie humaine chez l’immunodéprimé. Cette partie du travail sera coordonnée sur le plan de la microbiologie par P. Colson et sur le versant clinique par Y Berland et V. Moal. Le service clinique de Y Berland accueille une importante population de patients immunodéprimés, essentiellement greffés rénaux sous traitement immunosuppresseur. Ces patients développent fréquemment des pathologies infectieuses (hépatites, fièvres inexpliquées, pneumonies, diarrhées) sans que l’on puisse détecter un agent étiologique. Dans le cadre de notre recherche, les patients entrant dans ce cadre seront prélevés et les prélèvements seront analysés en métagénomique virale selon une procédure proche de celles déjà utilisées dans de récentes études (Nakamura S et al, 2009, Direct metagenomic detection of viral pathogens in nasal and fecal specimens using an unbiased high-throughput sequencing approach. 4:e4219). P. Colson et V. Moal poursuivrons en parallèle leurs travaux sur le virus de l’hépatite E, virus émergent dont la transmission dans les pays tropicaux et subtropicaux se fait essentiellement par l’eau et qui est suspecté d’être un agent de zoonose porcine dans les pays industrialisés. Son épidémiologie en Europe, où l’hépatite E était jusque récemment considérée comme une maladie importée, reste à clarifier. De plus, le VHE a été identifié depuis 2008 comme un agent émergent d’hépatite chronique et de cirrhose chez les transplantés de rein et de foie et les patients infectés par le VIH. Nous avons auparavant décrit l’existence d’un réservoir porcin du VHE en France d’un réservoir porcin en France [Kaba M et al. Frequent transmission of hepatitis E virus among piglets in farms in Southern France. J Med Virol. 2009;81(10):1750-9] et avons identifié une source alimentaire de transmission pour certains des cas diagnostiqués à l’hôpital de la Timone (Colson P et al. Pig liver sausage as a source of hepatitis E virus transmission to humans. Journal of Infectious Diseases, in press). Nous avons également décrit le 1er cas transfusionnel d’hépatite E en France [Colson P et al., Transfusion-associated hepatitis E, France. Emerg Infect Dis. 2007;13(4):648-9] et avons décrit des cas d’infections chroniques à VHE chez des patients transplantés de rein [Gérolami R et al., Hepatitis E virus as an emerging cause of chronic liver disease in organ transplant recipients. J Hepatol.2009;50(3):622-4] et chez des patients séropositifs VIH (Colson P et al., Acute and chronic hepatitis E in patients infected with human immunodeficiency virus. J Viral Hepatitis 2010, in press). Enfin nous avons décrit le premier cas de cirrhose compliquant une hépatite E chronique chez un transplanté rénal [Gerolami R et al., Chronic hepatitis E with cirrhosis in a kidney-transplant recipient. N Engl J Med 2008;358(8):859-60]. Nous allons poursuivre l’étude des sources et modes de transmission du virus de l’hépatite E dans la population générale et celle des patients immunodéprimés, en testant notamment diverses sources environnementales alimentaires, ainsi que la caractérisation des virus et des réponses immunes lors d’infections chroniques. Actuellement est réalisée une recherche clinique (AORC) qui a pour but de déterminer s’il existe une signature périphérique spécifique de l’hépatite E chronique chez les transplantés rénaux grâce à l’étude des ARN messagers transcrits au niveau du sang périphérique.


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