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Microbiologie & Sciences Humaines

Equipe n°1: Responsable Didier Raoult, PU-PH

Unité des Rickettsies et des pathogènes émergents

 

 

Composition de l’équipe

 

  1.  Didier RAOULT, PU-PH, HDR
  2.  Gilbert HABIB, PU-PH, HDR
  3.  Florence FENOLLAR, MCU-PH, HDR 2010
  4.  Bernard DAVOUST, vétérinaire militaire
  5.  Jean-Lou MARIE, vétérinaire militaire
  6.  Jean-Paul CASALTA, PH
  7.  Pierre-Yves LEVY, PH
  8.  Franck THUNY, PHU
  9.  Fadi BITTAR, Maître de Conférence, Chaire d’excellence IRD

 

L’unité des Rickettsies est la première unité de recherche qui a été bâtie dans l’URMITE actuelle. Elle est très profondément associée au Centre National de Référence pour les Rickettsies, Coxiella, Ehrlichia et Bartonella et a étendu le spectre de son activité sur les pathogènes émergents en général.

De ce fait, 5 projets regroupant des partenaires qui travaillent ensemble depuis longtemps vont être développés. Le premier projet sera autour du Centre National des Rickettsioses et des zoonoses émergentes, comprenant une part thérapeutique qui fera l’objet d’un deuxième projet spécifique. La maladie de Whipple pour lequel nous sommes les leaders mondiaux constituera le troisième projet. La poursuite de nos activités sur la recherche des causes d’infections et des stratégies de management dans le cadre des maladies infectieuses, notamment cardiologique, fera l’objet d’un quatrième projet. Enfin, le cinquième projet est développé pour la première fois dans l’URMITE en collaboration avec l’IRD du Sénégal ; il s’agit des microorganismes du tube digestif en Afrique.

 

Projet 1. Centre National de Référence des Rickettsioses et zoonoses émergentes - (DR, BD, JLM)


            Notre situation de centre de référence pour les rickettsioses, aussi bien sur le plan national que sur le plan international (par notre centre collaborateur OMS sur les rickettsies et les bactéries transmises par les arthropodes) nous amènent à être fréquemment sollicités pour aider à identifier des pathogènes dans des situations incomprises mais aussi à fournir des efforts permanents dans le développement de nouveaux outils diagnostiques.

      La première étape du diagnostic repose principalement sur les techniques sérologiques, qui ont souvent été aussi à l’origine de la première mise en cause de microorganismes comme agent pathogène. C’est une première étape qui nécessite toutefois d’être confirmée par des éléments diagnostiques directs : diagnostic moléculaire ou culture. Cette approche manque parfois de sensibilité et de spécificité avec de fréquentes réactions croisées entre microorganismes. Deux approches par immunoprotéomique et par immuno-PCR vont être développées afin d’améliorer cet outil diagnostique. En effet, nous sommes entrain d’appliquer une première approche par immunoprotéomique afin d’optimiser le diagnostic sérologique de la fièvre Q et des rickettsioses, notamment celles à R. conorii et R. africae. Nous allons tester par électrophorèse bidimensionnelle couplée au Western-blot des sérums de patients avec des infections bien documentées à C. burnetii, R. conorii, et R. africae ainsi qu’un groupe contrôle afin de détecter des cibles antigéniques potentielles de chacun de ces microorganismes. Les différentes cibles peptidiques spécifiques détectées seront identifiées par spectrométrie de masse. Ce qui permettra de pouvoir les produire sous forme de protéines recombinantes notamment par des systèmes d’expression in vitro. Les protéines recombinantes seront alors purifiées afin de servir de réactifs sérologiques pour des analyses à plus grand échelle par immunofluorescence indirecte et ELISA. Ces travaux nous permettront de gagner principalement en spécificité. Toutefois, une détection plus sensible est aussi nécessaire. Par exemple pour la fièvre Q, le diagnostic est trop tardif. L’application de techniques d’ImmunoPCR nous permettrait de gagner 4 à 5 jours dans le délai diagnostique. C’est donc une deuxième approche par ImmunoPCR que nous allons appliquer pour le diagnostic de la fièvre Q. Cette technique couple la technologie ELISA pour la reconnaissance immune mais la détection du signal, au lieu d’être effectué par des anticorps couplés à un substrat, se fera par des anticorps couplés à un fragment d’ADN permettant une amplification du signal par PCR et par conséquent d’être plus sensible.

      Enfin, nous allons persévérer dans le développement de puces sérologiques. Des puces sérologiques ont déjà été mis en place à l’unité des Rickettsies pour traiter les prélèvements en fonction de leur origine géographique. Ainsi nous avons des profils de puces antigéniques pour les patients présentant une fièvre dans le sud-est asiatique, une fièvre au retour d’Afrique Australe, ou encore une fièvre après piqûre d’arthropode en Europe, ou une fièvre dans un contexte particulier, telle qu’endocardite. Ces puces nous permettront aussi de rechercher le rôle pathogène potentiel de bactéries nouvellement isolées à l’URMITE, telles que Diplorickettsia massiliensis et Occidentia massiliensis. Ces travaux procèdent d'une démarche originale et innovante ; ils pourront bénéficier de retombées dans le domaine socio-économique.

Nous avons récemment commencé à développer de nouvelles approches diagnostiques rapides. Nous avons débuté la mise au point de l’analyse par PCR spécifique Coxiella burnetii en temps réel d’écouvillon pharyngé pour le diagnostic de fièvre Q. Nous sommes entrain de mettre au point la réalisation d’écouvillonnage d’escarre d’inoculation pour le diagnostic des rickettsies, au lieu de biopsies cutanées, suivi d’une analyse par biologie moléculaire par PCR spécifique en temps réel. Ces stratégies diagnostiques reposant sur des prélèvements ne nécessitant par une importante technicité suivi de PCR spécifiques en temps réel adaptés permettront de proposer un diagnostic rapide et fiable à plus grande échelle.

Enfin, depuis plusieurs années, nous avons contribué à la découverte d’un certain nombre de pathogènes zoonotiques émergents. Notre objectif est de continuer à persévérer dans cet axe en appliquant une stratégie rigoureuse. Il s’agit tout d’abord de multiplier les sources de prélèvements. La présence au sein de notre équipe de deux vétérinaires militaires va nous permettre de continuer à obtenir des prélèvements tout à fait atypiques. Il s’agit notamment de prélèvements d’animaux sauvages mais aussi de tiques, de poux, de puces, ou autres ectoparasites, qui ont permis ces dernières années la découverte de nouveaux microorganismes. Certains de ces travaux seront réalisés en collaboration avec l’équipe du Pr Philippe Parola. Enfin, l’inclusion au sein de notre UMR d’une équipe de l’IRD avec le Dr Oleg Mediannikov, va nous permettre la réalisation de prélèvements d’origine humaine et animale en Afrique, notamment par l’intermédiaire de notre antenne à Dakar.

 

Projet 2. Thérapeutique des infections à bactéries intracellulaires (DR, FF, PYL)


            La prise en charge des infections à bactéries intracellulaires fastidieuses est souvent une impasse thérapeutique. De plus, l’accroissement des résistances des bactéries aux antibiotiques posent de plus en plus de problème. Notre projet concernant cette thématique comprendra deux axes et sera réalisé en collaboration avec l’équipe du Pr Jean-Marc Rolain.

      1. L’optimisation de la prise en charge des infections à bactéries intracellulaires sera réalisée par le diagnostic moléculaire des résistances. Pour la maladie de Whipple, par exemple, nous avons mis récemment en évidence la présence de mutations au niveau du gène FolP de souches de Tropheryma whipplei de patients présentant des résistances cliniques au traitement par sulfaméthoxazole-triméthoprime. Or, cette molécule est encore largement prescrite en première intention chez les patients atteints de maladie de Whipple. Nous sommes entrain de développer un outil qui permettra chez tous les patients au moment du diagnostic de cette infection de rechercher la présence de mutations laissant suspecter une résistance de la bactérie à cet antibiotique ou un fort risque de développement de résistance. En ce qui concerne la fièvre Q, deux génomes complets de C. burnetii, un premier d’une souche sensible à la doxycycline et un second d’une souche résistante à la doxycyline ont été séquencés. Leur analyse bioinformatique va permettre de pouvoir mettre en évidence des mutations sur les gènes cibles. Dans le futur, l’amplification couplée au séquençage de ces gènes devrait permettre de pouvoir détecter les patients atteints par des souches potentiellement résistantes.

      2. De nouvelles approches thérapeutiques sont entrain d’être évaluées. Des travaux récents suggèrent que les statines, molécules au départ prescrites contre l’hypercholestérolémie, auraient aussi un effet bénéfique lors d’infections. Des modèles in vitro sur culture cellulaire ont montré que les statines (notamment la lovastatine) avaient une activité contre C. burnetii et R. conorii. Ces résultats préliminaires, même s’ils requièrent d’être confirmés et élargis, nous permettent de supposer que certaines statines pourraient prévenir ou modérer les manifestations cliniques de la fièvre Q et des rickettsioses chez les personnes exposées. Un modèle animal a aussi récemment permis de montrer l’efficacité des statines vis à vis de Yersinia pestis, confortant donc le potentiel de ces molécules comme agents anti-infectieux.

      L’oméprazole, est un inhibiteur de la pompe à protons, qui est particulièrement prescrit dans le traitement de reflux gastro-œsophagiens ou d’ulcères gastroduodénaux. Des travaux préliminaires laissent suggérer que cette molécule a aussi un effet direct sur la multiplication de C. burnetii et pourra donc être prescrit dans le traitement de la fièvre Q.

      Dans le futur, nous pourrons aussi explorer l’impact de ces molécules en prophylaxie d’infections, notamment liées à bactéries intracellulaires, que ce soit seul ou associé éventuellement à des antibiotiques.

 

Projet 3. Tropheryma whipplei et la maladie de Whipple (FF, DR, FB)


En 2000, le premier isolement de Tropheryma whipplei, la bactérie responsable de la maladie de Whipple, a été réalisée à l’URMITE, nous permettant d’entreprendre des recherches afin de tracer son histoire naturelle mais aussi de proposer un centre de diagnostic et de conseil thérapeutique. La maladie de Whipple a été considérée pendant longtemps comme une maladie métabolique puis comme une maladie rare due à une bactérie rare. En fait, grâce à nos travaux, nous savons désormais que T. whipplei est une bactérie fréquente responsable d’infections aiguës (gastro-entérite, pneumopathie, bactériémie), de portages asymptomatiques (selles, salive), d’infections chroniques localisées à des organes autres que le tube digestif ou encore de maladie de Whipple telle que décrite depuis le début. Cette dernière infection est grave et repose vraisemblablement sur des causes génétiques. Notre projet s’inscrit dans la continuité de notre activité passée.

Nous allons approfondir les études épidémiologiques sur la bactérie en effectuant d’une part des enquêtes familiales chez les patients atteints d’infections à T. whipplei ainsi que les porteurs asymptomatiques et en réalisant d’autre part des études de séroprévalence en France et au Sénégal. La richesse des prélèvements que nous recevons dans notre centre (13.382 prélèvements reçus depuis 2001, dont 3.618 en 2009) nous permet d’être confrontée à de nouvelles situations qui devraient nous permettre de mieux connaître le panel d’infections liées à T. whipplei. Une étude, réalisée par l’intermédiaire d’un PHRC, sur les prélèvements de selles et de salive d’enfants de moins de 6 ans se présentant aux urgences de l’hôpital Nord à Marseille, quelque soit leur motif, est en cours. Elle permettra de conforter le rôle de T. whipplei comme agent le plus fréquemment responsable de gastro-entérite.

Des efforts doivent être encore fournis afin d’optimiser le diagnostic des infections à T. whipplei. Certes, l’outil sérologique par western-blot ciblant T. whipplei nous permet depuis récemment une bonne discrimination entre les porteurs asymptomatiques et les patients et il devra être appliqué systématiquement chez tous les patients présentant une PCR positive à T. whipplei. Cependant, le diagnostic de certaines infections à T. whipplei telles que les endocardites ou les encéphalites reste encore très difficile. L’optimisation des techniques de culture de T. whipplei devra être réalisée afin d’isoler de nouvelles souches. Nos défis seront notamment d’obtenir des isolats de T. whipplei à partir de prélèvements de salive de patients, de selles de patients atteints de gastroentérite, ainsi que de prélèvements de selles et salive de porteurs asymptomatiques de la bactérie.

Un siècle après sa description et 10 ans après l’isolement de la bactérie en cause permettant une approche thérapeutique plus rationnelle, le traitement de la maladie de Whipple classique reste toujours difficile et complexe. Il faut souligner le contraste entre l’efficacité spectaculaire des antibiotiques et le manque d’efficacité du traitement par sulfaméthoxazole-triméthoprime d’une durée de 18 mois, voir plus. L’évaluation des nouveaux protocoles thérapeutiques est en cours. Pour l’effectuer au mieux un suivi des patients très rigoureux est entrain d’être mis en place. L’analyse des biopsies duodénales devra être aussi affinée du point de vue qualitatif et quantitatif. Ce suivi devra être réalisé au long cours, idéalement à vie. La prise en charge des patients devra aussi être adaptée, au fur et à mesure, à partir de l’expérience acquise. Une des questions sera aussi la prise en charge spécifique des sujets porteurs a priori asymptomatiques de T. whipplei. Il faudra, en effet, systématiquement rechercher la présence d’une réponse immunitaire par sérologie western-blot chez tous les sujets ayant une PCR T. whipplei positive dans les selles, la salive et les biopsies digestives sans autre prélèvement positif. La question de l’intérêt d’un suivi au long cours des porteurs reste poser.

            La recherche des facteurs génétiques et des déficits immunitaires spécifiques prédisposant à la maladie de Whipple est aussi un de nos objectifs. Il existe actuellement un faisceau d’arguments très fort montrant que la survenue de la maladie de Whipple dépendrait pour une large part de la susceptibilité/résistance génétiquement déterminée de l’hôte infecté. Cette grande variabilité de réponse à l’infection à T. whipplei, et en particulier le fait que la plupart des individus peuvent être considérés comme résistants au développement de la maladie de Whipple, est un argument majeur en faveur du rôle de facteurs génétiques de l’hôte dans cette maladie infectieuse. Nous formulons comme hypothèse que la maladie de Whipple témoigne d’une prédisposition génétique mendélienne, c’est-à-dire qu’elle relève de nouveaux types de déficits immunitaires héréditaires. L’objectif de notre travail visera donc à identifier les bases moléculaires de la prédisposition à la maladie de Whipple. Ce travail sera réalisé en collaboration avec le département de Génétique Médicale des Maladies Infectieuses du Pr Jean-Laurent Casanova et du Dr Laurent Abel, Hôpital Necker, Paris. Le recrutement des patients et la constitution d’une banque de prélèvements sont en cours. Lors de leur consultation à Marseille, un entretien, une biopsie de peau et une prise de sang, pour constituer notamment une DNAthèque, une sérothèque et une cellulothèque, sont réalisés chez les patients consentants. Les études immunitaires fonctionnelles et moléculaires, l’étude d’épidémiologie génétique ainsi que la recherche de mutations par une approche "gène candidat" d’après les connaissances des voies de la réponse immunitaire seront réalisées ainsi que l’analyse de l’ensemble des données et au criblage génomique complet (en fonction des caractéristiques des familles recueillies). L'identification des gènes de prédisposition à la maladie de Whipple aura des implications majeures tant sur le plan immunologique (dissection des mécanismes de la réponse immunitaire) que clinique (conduite à tenir vis à vis des porteurs sains de la bactérie, traitement orienté vers la restauration d'une réponse immunitaire déficiente, stratégies de prévention chez les personnes génétiquement prédisposées).

 

Projet 4. Cardiologie infectieuse (GH, JPC, FT, DR)


Cela fait de nombreuses années que la cardiologie infectieuse est une des thématiques phares de notre UMR (GH, JPC, FT, DR). Depuis 1994, nous avons développé un kit diagnostique permettant la réalisation d’examens paracliniques systématisés dans le cadre du diagnostic des endocardites infectieuses et assurant aussi le recueil des éléments épidémio-cliniques de manière standardisée. La composition de ce kit diagnostique a été régulièrement réévaluée et adaptée au fil de l’eau en fonction de l’avancée de nos connaissances. Actuellement, plus de 3000 patients présentant une suspicion d’endocardite infectieuse sont inclus dans notre base. En se basant sur cette même approche, nous avons constitué un kit diagnostique pour les péricardites.

Notre premier axe de recherche concernant cette thématique sera de persévérer dans l’optimisation du diagnostic étiologique et le développement d’outils diagnostiques et d’outils d’évaluation du pronostic. Le diagnostic étiologique est capital car son absence est un facteur de mauvais pronostic dans la prise en charge du patient. Nos premiers travaux sur les endocardites ont permis une meilleure détection des bactéries fastidieuses ou de bactéries chez des patients déjà sous antibiotiques ainsi que la mise en évidence d’endocardites non infectieuses. En effet, nous avons récemment mis en évidence des tableaux d’endocardites inflammatoires isolées (nous ayant conduit à la recherche un peu plus systématique de facteurs rhumatoïdes et d’anticorps anti-nucléaires), des endocardites allergiques (nous laissant suggérer la nécessité de la rechercher d’anticorps anti-porcs) ainsi que des endocardites liées à la réaction du greffon contre l'hôte. Nous avons récemment développé la réalisation d’un panel de PCR spécifique dans le sang qui semble améliorer le diagnostic étiologique. Nous avons aussi pour objectif d’appliquer une méthode d’amplification différentielle basée sur l’hybridation différentielle de tissus infectés et non infectés afin de mettre en évidence d’éventuels agents infectieux, y compris des virus. Un essai préliminaire de cette méthode nous avait permis d’identifier a posteriori le rôle pathogène de Mycobacterium tuberculosis dans une endocardite récidivante et mortelle.

            Récemment nous avons publié un travail sur l’état du profil transcriptionnel des valves cardiaques et celui du sang total de patients atteints d’endocardite infectieuse. Cette étude réalisée à partir de l’analyse de l’ensemble du génome humain a permis de mettre en évidence une sur-expression de certains gènes, jamais impliqués auparavant dans l’endocardite infectieuse, dont notamment celui de l’aquaporine-9 (AQP-9) qui est une protéine membranaire régulant la perméabilité de l’eau et ainsi les flux hydriques, principalement connue pour être impliquée dans des processus tels que la réponse immunitaire, l'œdème dans la réponse inflammatoire mais également dans des syndromes comme l’insuffisance rénale et l’insuffisance cardiaque. Notre hypothèse de travail désormais est de savoir si le dosage sérique ou l’amplification du gène de l’AQP-9 chez les patients atteints d’endocardite infectieuse pourrait être un facteur prédictif d’évolution défavorable vers notamment une défaillance hémodynamique. Pour tester cette hypothèse nous doserons l’AQP-9 (technique ELISA) et nous analyserons l’expression de son gène (PCR) dans une cohorte de patients hospitalisés pour endocardite infectieuse. L’intérêt pronostique de l’analyse de l’AQP-9 sera comparé avec celui des autres facteurs connus dont notamment le BNP dont on sait qu’il est un marqueur d’insuffisance cardiaque. Si les résultats allaient en faveur d’un intérêt de l’AQP-9, nous pourrions baser une partie de nos indications chirurgicales sur ce dosage et ainsi permettre de diminuer la mortalité.

Notre deuxième axe de recherche vise à optimiser la prise en charge thérapeutique des endocardites infectieuses. En effet, leur traitement est très hétérogène, sujet à caution, y compris au sein d’un même centre hospitalier, avec en particulier un faible taux de compliance aux recommandations. Ce constat a conduit notre laboratoire à proposer depuis 2002, un protocole thérapeutique simplifié et rationnel utilisant uniquement quatre molécules antibiotiques. Ce protocole a été appliqué systématiquement aux patients hospitalisés pour endocardite infectieuse. L’efficacité de cette stratégie thérapeutique standardisée, mais également la compliance des services hospitaliers, seront évaluées. Un autre projet thérapeutique visera à évaluer sous la forme d’une étude prospective l’utilité des statines pour prévenir la survenue des endocardites ou diminuer leur sévérité. En effet, des études récentes suggèrent une efficacité de ces molécules pour réduire l’incidence des infections, notamment chez les patients atteints de maladie cardio-vasculaire.

            Notre troisième axe de recherche ciblera plus spécifiquement les péricardites avec l’analyse rétrospective de la série de kit péricardite. Cette dernière permettra d’établir le panel des différents diagnostiques étiologiques et d’évaluer la proportion de cas sans diagnostic étiologique. Un projet de pathovirome en collaboration avec l’équipe du Dr Christelle Desnues sera aussi débuté. L’objectif de ce travail sera d’une part de cataloguer le « virome » humain à partir de prélèvements de liquides ou de biopsies péricardiques et d’autre part d’identifier de nouveaux pathogènes impliqués dans les péricardites.

 

Projet 5. Pathogènes émergents digestifs en Afrique (DR, FF, BD, JLM)


            L’inclusion d’une équipe IRD dans notre UMR nous a conduit à nous intéresser aux pathogènes émergents et aux prélèvements de selles en Afrique. Des premiers travaux effectués au Sénégal en zone rurale, sur des selles humaines, nous ont permis de mettre en évidence une importante prévalence du portage de T. whipplei dans les selles, mais aussi d’établir un lien avec des épisodes diarrhéiques. En effet, nous avons réussi à montrer que jusqu’à 44% des enfants entre 2 et 10 ans étaient porteurs de la bactérie dans les selles à Ndiop et Dielmo, 2 villages de la région du Sine-Saloum.

            Nous sommes aussi entrain de réaliser de manière exhaustive le répertoire des bactéries présentes dans un prélèvement de selles d’adulte sain en provenance du Sénégal. Nous appliquons 3 approches complémentaires : les PCR ciblées, la métagénomique et la culture sur un panel exhaustif de milieux de diverses compositions dans des conditions atmosphériques et de pH extrêmement variées, couplée à l’identification des colonies par MALDI-TOF et PCR ciblant l’ARN 16S ribosomique suivi de séquençage. Actuellement, 88 bactéries ont été isolées dont une nouvelle espèce ainsi qu’une dizaine d’espèces jamais décrites chez l’homme. Cette triple approche nous permet aussi de comparer les différentes méthodes. Notamment, nous sommes entrain de nous apercevoir que la métagénomique ne permet de détecter les bactéries que lorsqu’elles sont présentes en très grande quantité dans le prélèvement (108) alors que la culture, certes plus fastidieuse, permet de mettre en évidence des bactéries même faiblement présentes grâce à l’utilisation de conditions spécifiques. Ces approches vont être appliquées à plus grande échelle à l’Afrique. Nous avons d’ailleurs débuté un travail en collaboration avec l’Institut Pasteur de Dakar sur 160 selles de patients Sénégalais présentant une gastroentérite versus un groupe contrôle de sujets sans diarrhée. Nous allons aussi mettre en application ces techniques sur des prélèvements de selles de voyageurs en Afrique. Nous pourrons ainsi établir le répertoire des bactéries présentes dans les selles avant le départ, lors d’un éventuel épisode diarrhéique en Afrique et au retour. Nous allons élargir la recherche de microorganismes dans ces selles en collaboration avec l’équipe du Pr Bernard La Scola, en mettant en place des techniques de culture de ces échantillons sur amibes, afin d’isoler des virus géants. Nous avons d’ailleurs lors d’un premier essai réussi à isoler un nouveau type de Marseille virus à partir de selles. Enfin, un projet en relation avec l’équipe du Pr Michel Drancourt nous permettra de mettre au point des puces à ADN permettant de tester l’ensemble des pathogènes suspects d’être responsable de diarrhée et de les tester à grande échelle.

            Nous allons aussi effectuer le répertoire bactérien des selles de primates. En effet, observer les primates est essentiel pour l’étude de certaines maladies qui circulent entre l’animal et l’homme. Des chercheurs ont déjà réussi à mettre en évidence les anticorps dirigés contre les homologues simiens du VIH et séquencé aussi l’ARN viral présent dans les selles. La présence de Plasmodium falciparum a aussi été détectée dans les selles de gorilles. Notre connexion avec le monde vétérinaire et des collaborations antérieures avec le Centre de Primatologie du Centre International de Recherche Médicale de Franceville (Gabon) va nous permettre, par l’intermédiaire de convention de recherche de réaliser la collecte de selles de primates que ce soit en captivité, mais aussi dans le milieu naturel. Outre le répertoire bactérien, nous allons rechercher dans ces selles le virus de l’hépatite E ainsi que les anticorps dirigés contre ce dernier en collaboration avec le Dr Philippe Colson.


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